本发明提供了一株硫丹降解菌NS及其固定化酶在土壤中的应用,保藏号为CCTCC No:M2012327。是一株在偏碱性环境中具有降解硫丹能力的硫丹降解菌NS,能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的硫丹,从而降低硫丹对环境造成的危害,起到修复硫丹污染土壤、保护生态环境的作用。利用该菌株制备的固定化酶制备工艺简单,成本低、效率高、无二次污染,具有重要的现实价值和很好的应用前景。
1.一株保藏号为CCTCCxa0NO:M2012327的百日咳博名特氏菌NS(Bordetellaxa0petriixa0NS),其特征在于已于2012年9月6日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心CCTCC;其16Sxa0rDNA序列如SEQxa0IDxa0NO:1所示。xa0技术领域
本发明涉及一株硫丹降解菌NS及其固定化酶在土壤中的应用,属于生物降解处理技术领域。
背景技术
硫丹(Endosulfan)的化学名为1,2,3,4,7,7-六氯双环(2,2,1)庚-2-烯-5,6-双羟甲基亚硫酸酯,分子式为C₉H₆Cl₆O₃S,分子量为406.91,硫丹原药在常温常压下为固体,常为两种异构体(α-硫丹和β-硫丹,二者比例为7:3)的混合物,化学结构式如下:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>硫丹纯品为白色晶体,混合物为棕色晶体。具有二氧化硫气味;硫丹的相对密度为1.745g/cm³,在25°C的饱和蒸气压1.33×10³Pa,熔点为70-100°C;不溶于水,溶于二甲苯、氯仿、丙酮等有机溶剂;在碱性质中不稳定,并缓慢水解为二醇和二氧化硫;遇湿气逐渐分解失效;不准存放于强氧化剂、强酸、强碱、潮湿空气等环境中,对日光稳定。α-硫丹和β-硫丹有明显的亲脂性,非常接近于联合国环境规划署确定的POPs物质logKOW>5的标准,表明硫丹具有生物积累的潜力。在2011年召开的《斯德哥尔摩公约》第五次缔约方大会上,硫丹被列入禁用物质列表,全球将在5年后实现禁止硫丹的生产、使用和进出口。硫丹最早由德国FarbwerkHoechst公司1954年研制开发,为有机氯杀虫剂,使用历史已经超过50年,在农业中累计全球使用硫丹量估计是30.8万吨。硫丹在我国被广泛使用,每年硫丹的使用量估计平均2800吨。硫丹进入环境的主要途径是在农业生产中的大规模使用,致使大面积的土壤、水源受到了硫丹的污染。在我国硫丹被广泛应用于棉田和茶叶的病虫害防治,造成了严重的土壤污染和农作物硫丹残留的超标,同时由于硫丹能在鱼体内富集,也造成了水产品硫丹超标。由于硫丹的喷雾施用,大气中也有一定量的残留,使它能够进行远距离的转运。代谢产物硫酸酯、醇、醚、羟基醚和内酯,但只有硫丹硫酸酯仍然含硫元素,具有比硫丹更高的毒性。目前,除了禁止硫丹的生产使用外,还没有方法用于修复硫丹污染土壤。固定化酶是在生物修复的基础上发展起来的一项污染修复技术,被认为是有机污染物生物修复技术中最有效、最可行和最可靠的方法。酶的固定化是将原来游离的水溶酶限制或固定于某一局部的空间或固体载体上,固定化酶经过过滤或离心后,可长期反复使用。固定化方法有物理吸附法、交联法、共价结合法及包埋法等。包埋法不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基,反应条件温和,很少改变酶结构,应用最为广泛。本发明利用硫丹降解菌的固定化酶投加于土壤中,能够迅速降解硫丹,缩短硫丹的半衰期这一特点,筛选出具有降解硫丹能力的微生物,提取其降解酶并将其固定化,应用于硫丹污染土壤中,以达到修复硫丹污染土壤的目的。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一株硫丹降解菌NS及其固定化酶在土壤中的应用;本发明筛选出在偏碱性环境中具有降解硫丹能力的硫丹降解菌NS,以达到修复硫丹污染土壤的目的。本发明从生产硫丹农药的污水处理厂排放的污水中采集分离得到了一株硫丹降解菌NS,属于Bordetellaxa0petrii,经实验证明其对硫丹具有降解能力。一株硫丹降解菌NS(Bordetellaxa0petriixa0NS),已于2012年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),地址:中国武汉武汉大学;保藏号为CCTCCxa0No:Mxa02012327。所述一株硫丹降解菌NS形态特征如下:NS菌落呈粉红色,不透明,表面光滑,菌落为圆形,较小,四周规则,显微镜下观察细胞呈杆状,革兰氏染色阳性。以硫丹降解菌NS的总DNA为模板,利用细菌16Sxa0rDNA通用引物(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1392R:ACGGGCGGTGTGTAC)进行PCR扩增,得到约为1.4kb的扩增产物,测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成,其核苷酸序列如SEQxa0IDxa0NOxa01所示。根据Genexa0Bank序列同源性比较,硫丹降解菌NS与Bordetellaxa0pexa0trii同处于一个最小的分支,同源性高达99%。结合菌株的生理生化特征,将硫丹降解菌NS初步鉴定为百日咳博名特氏菌NS(Bordetellaxa0petriixa0NS),命名为硫丹降解菌NS(Bordetellaxa0petriixa0NS)。经对硫丹降解菌NS的降解特性研究发现:适宜NS生长及其对硫丹降解率达到最大时的温度是35°C,pH为8.0,接菌量2%;在最佳温度和pH条件下,硫丹降解菌NS5d内对100μg·mL^-1硫丹的降解率达到80%以上,21d时硫丹几乎被全部降解。通过GC-MS分析,硫丹在硫丹降解菌NS作用下降解形成硫丹二醇、硫丹内酯和硫丹醚,并未发现高毒的降解产物硫丹硫酸盐。将从硫丹降解菌NS中提取到的硫丹降解酶进行固定化,测定其在硫丹污染土壤中的降解能力。结果表明,投加硫丹降解菌NS的固定化酶后加快了土壤中硫丹的降解,降低了硫丹对土壤和环境的生态毒性。本发明的有益效果主要体现在:本发明硫丹降解菌NS可通过制成固定化酶的方式应用于环境中硫丹的降解,能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的硫丹,从而降低硫丹对环境造成的危害,起到修复硫丹污染土壤、保护生态环境的作用。该菌株的固定化酶制备工艺简单,成本低、效率高、无二次污染,具有重要的现实价值和很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明菌株NS扫描电镜图片;图2为本发明菌株NS的系统发育树图;该图可以看出菌株NS与同源菌株的进化关系;图3为分离纯化培养基中硫丹样品的气相色谱图以此为基准计算出NS对硫丹的降解率;图4为NS的生长曲线和对浓度为100mg/L的硫丹的降解曲线图该图说明了菌株NS在5d时对硫丹的降解率就可达到80%左右;图5为初始pH值对菌株NS的生长和降解能力的影响(5d)通过该图可判断菌株NS降解硫丹时的最适pH;图6为初始硫丹浓度对菌株NS的生长和降解能力的影响(5d)通过该图可判断菌株NS降解硫丹时的最适硫丹浓度;图7为初始加菌量对菌株NS的生长和降解能力的影响(5d)通过该图可判断菌株NS降解硫丹时的最适加菌量;图8为初始温度对菌株NS的生长和降解能力的影响(5d)通过该图可判断菌株NS降解硫丹时的最适温度;图9为菌株NS在最适条件下的降解动态(21d)该图反映了菌株NS在最适条件下随着时间变化快速降解硫丹的过程;图10为硫丹降解后样品的总离子流扫描图谱(图10由气相质谱仪系统自动形成)通过该图可确定NS降解硫丹所产生的降解产物;
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:实施例1:硫丹降解菌NS的筛选与鉴定培养基:无机盐基础培养基:5.8gxa0K₂HPO₄,4.5gxa0KH₂PO₄,2.0g(NH₄)₂SO₄,0.16gxa0MgSO₄,0.02gxa0CaCl₂,0.002xa0gxa0Na₂MoO₄,0.001xa0gxa0FeSO₄,0.001xa0gxa0MnCl₂,去离子水1L,调至pH7.0,121°C灭菌30min。含少量碳源培养基:上述无机盐基础培养基中添加5.0g蛋白胨,调至pH7.0,121°C灭菌30min。分离纯化培养基:上述含少量碳源培养基中加入硫丹,使培养基中硫丹的浓度为100μg·mL^-1,琼脂15.0g,调至pH7.0,121°C灭菌30min。LB培养基:蛋白胨10.0g,酵母膏5.0g,NaCl10.0g溶于1L去离子水中,调pH至7.0,121°C灭菌30min。1)菌株富集分离:将农药厂采集的硫丹排放口污泥、土壤和水样作为微生物富集分离培养的来源。采用直接分离法和液体富集培养两种方法,从所采集的样品中分离硫丹降解菌。直接分离法:取污泥5g或污水5mL于含无菌水95mL的三角瓶中,即得到10^-2的土壤稀释液;用灭菌的1mL移液管移取0.5mL10^-2的土壤稀释液,注入一支盛有4.5mL无菌水的试管中,充分摇匀,即得10^-3稀释液;再换一支1mL灭菌的移液管吸取0.5mLxa010^-3稀释液,注入一支盛有4.5mL无菌水的试管中,充分摇匀,即得10^-4稀释液。依此类推,连续稀释,配成10^-5、10^-6等一系列浓度稀释液,供平板分离用。将10^-4、10^-5、10^-6三个浓度的污泥稀释液接种到含有100μg·mL^-1硫丹的分离纯化培养基平板上。用涂布棒涂布均匀,置于30°C生化培养箱中培养,所得的微生物进行分离纯化,纯化后即得到几株有降解能力的菌株,保存待用。液体富集培养法:称取污泥10g放入100mL无机盐基础培养基中,培养基中硫丹的浓度为200μg·mL^-1,于30°C,130r·min^-1摇床培养,培养一周后,以10%的接种量接入无机盐基础培养基中,以后每周转移一次,如此反复多次驯化。最后,用平板稀释法进行分离纯化,纯化后即得到几株有降解能力的菌株,保存待用。将上述分离纯化得到的几株菌种分别于培养皿中接菌培养48h,加入适量的灭菌水,并用接菌环轻轻刮取表面的菌落,制成粗制菌悬液,将其转移至150mL灭菌的三角瓶中,用生理盐水调制菌体浓度使其OD₆₀₀为1.0,于振荡培养箱中振荡培养3h,以消除菌体携带的营养组分。然后用灭菌水调整菌体浓度,配制成OD₆₀₀为1.0的硫丹降解菌菌悬液,备用。配制含100μg·mL^-1硫丹的分离纯化培养基,取5mL加入到18mm×180mm的试管中,每个菌种设3个重复的试管,将上述制备好的OD600在1.0左右的菌悬液按每个试管2%(质量比)的接菌量接种。30°C,160r·min^-1避光振荡培养,培养5d后取出试管,测定硫丹的残留浓度,求出降解率。选取其中降解率较高的菌株命名为NS。2)菌株鉴定:将上述获得的NS菌株进行菌落形态和生理生化鉴定,该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为:NS菌落呈粉红色,不透明,表面光滑,菌落为圆形,较小,四周规则,显微镜下观察细胞呈杆状,革兰氏染色阳性。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0,温度30°C。该菌株经16Sxa0rDNA序列分析鉴定为Bordetellaxa0petrii。实施例2硫丹降解菌NSxa016Sxa0rDNA序列分析1.硫丹降解菌NS总DNA的提取实验中利用MIxa0BIOxa0PowerSoilxa0DNAxa0Isolationxa0Kit提取土壤中总DNA,主要操作步骤在原使用说明的基础上稍加改进,具体流程如下:1)菌体培养:接种硫丹降解菌NS于LB培养基,于30°C振荡培养18h;2)菌体收集:称量10ml离心管空管重量并记录。取5mL培养液于10mL离心管中,8000r·min^-1离心8min,弃上清液,收集菌体。再次称量装有菌体的10ml离心管重量并记录,两次称量值之差即为该菌体质量。以无菌水:菌体(质量比)3:1的比例稀释并混匀,即得菌悬液;3)打开水浴锅,调至60°C,将Solutionxa0C1放入水浴锅中,使沉淀消失;4)取步骤2)中收集到的菌悬液0.5mL添加到PowerBead管中,轻轻的漩涡混合;5)在PowerBead管中加入60xa0μLxa0Solutionxa0C1,短暂涡旋混匀;6)旋涡振荡10min;7)室温下,10000×g离心2min;8)避开土壤颗粒,转移500μL上清液至干净的2mL收集管中;9)往2mL收集管中加入250μLxa0Solutxa0ionxa0C2,涡旋振荡5s后,在4°C下培养5min;10)室温下,10,000×g,离心2mL收集管3min;11)避开颗粒,转移650xa0μL的上清液至干净的2mL收集管中;12)往2mL收集管中加入200μLxa0Solutxa0ionxa0C3,短暂涡旋振荡后,在4°C下培养5min;13)室温下,10,000×g,离心2mL收集管3min;14)避开颗粒,转移750xa0μL的上清液至干净的2mL收集管中;15)摇晃混合Solutionxa0C4后,往2mL收集管中加入1,200μLxa0Solutionxa0C4,涡旋振荡5s。16)移取大约675xa0μL上清液到Spinxa0Filter,室温下,10,000×g,离心3min。倒掉废液,再加入675μL上清液到Spinxa0Filter,室温下,10,000×g,离心3min。倒掉废液,加入剩余的上清液到Spinxa0Filter,室温下,10,000×g,离心3min;17)往Spinxa0Filter中加入500xa0μLxa0Solutionxa0C5,室温下,10,000×g,离心2xa0min;18)倒掉废液后,室温下,10,000×g,空离心Spinxa0Filterxa03xa0min;19)小心把Spinxa0Filter放入干净的2mL收集管中,避免Solutionxa0C5溅洒在Spinxa0Filter上;20)加入60xa0μLxa0Solutionxa0C6于中央白色滤膜处,洗脱Spinxa0Filter膜;21)室温下,10,000×g,离心3min;22)丢弃Spinxa0Filter,于-20°C保存管中DNA。向中收集到的菌体中2.硫丹降解菌NS的16Sxa0rDNA扩增引物:5’端引物为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’),3’端引物为1392R(5’-ACGGGCGGTGTGTAC-3’)。PCR扩增反应体系(50μL):5.0μLxa010×PCRxa0Buffer,2.0μL2.5mMxa0dNTP混合液,5.0μLxa025mMxa0MgCl2溶液,2.0μL引物1(27F),2.0μL引物2(1392R),1.0μLxa0Taqxa0DNA聚合酶,1.0μL模板DNA,32.0μL双蒸水。PCR反应条件:94°C预变性1min;94°C变性1min,58°C退火1min,72°C延伸2min,循环反应28次,72°C延伸10min,10°C保温。取5μL反应物在合适的琼脂糖凝胶中检查PCR产物的预期大小,用EB染色,在紫外光下观察目的基因。3)16Sxa0rDNA序列测定测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成,其核苷酸序列如SEQxa0IDxa0NOxa01所示。硫丹降解菌NS系统发育树如图2所示。实施例3:降解菌NS的降解特性分离纯化培养基中硫丹的提取:将硫丹降解菌NS接种到分离纯化培养基中培养5d,加入5mL的正己烷,旋涡混合器上充分振荡提取,静置分层,取有机相。硫丹的测定:气相色谱分析:岛津GC-14C气相色谱仪,毛细管柱(OV-1701)0.53mm×30m,FID检测器。进样口温度260°C,柱温240°C,检测器260°C,N₂流速25mL·min^-1,进样量2xa0μL。菌悬液对硫丹降解率的计算公式: R = ρ ck - ρ ρ ck × 100 % ]]>式中:R:硫丹降解菌的降解率(%);ρ:接菌处理培养液中硫丹的浓度(μg·mL^-1);ρ_ck:未接菌对照培养液中硫丹的浓度(μg·mL^-1)。GC测定硫丹的含量计算:根据样品色谱峰和标样色谱峰的峰高,利用外标法计算培养液中硫丹的浓度。计算公式如下: C X = C X × M X M 0 × V 0 V X ]]>式中:C_X:培养液中硫丹浓度(μg·mL^-1);M_X:样品色谱峰峰面积(mv);V_X:样品进样量(μL);V₀:标样进样量(μL);H₀:标样色谱峰峰面积(mv);C₀:标样浓度(μg·mL^-1)。1)向含少量碳源培养基中添加硫丹标样,设定四组不同硫丹浓度的培养液,四组培养液中硫丹浓度分别为10、20、50、100、200μg·mL^-1,每组设6个重复,按照上述硫丹的提取和测定试验方法,提取出各组培养液的硫丹,然后在选定的GC-FID色谱条件下测定四组培养液中实际提取出的硫丹浓度,并计算添加回收率及变异系数。测得四组分离纯化培养基中α-硫丹的添加回收率为85.41%-89.59%,变异系数小于3.8%,β-硫丹的添加回收率为95.19%-101.04%,变异系数小于4.7%,完全符合农药残留提取方法要求。从标准添加浓度的回收率情况看,硫丹的提取和测定方法能满足培养液中硫丹残留分析要求。在所述的色谱条件下,硫丹标样、测定样品谱图分别为图3和图4。由以上两个谱图可以看出,在该色谱条件下样品峰形好,无杂质峰干扰,灵敏度高,且保留时间也比较合适。2)pH值对降解细菌的生长和降解能力的影响:调整分离纯化培养基的pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,其中硫丹的浓度为100μg·mL^-1,按3%的接菌量(质量比)接种硫丹降解菌NS的菌悬液,30°C,160r·min^-1下避光振荡培养,5d后取样,测定培养液的OD₆₀₀值,计算降解菌的生长量;重复3次,同时设3个不接菌的对照处理,对培养液中残留硫丹进行提取测定,计算硫丹的降解率。实验结果如图5所示,结果表明:pH值对细菌的降解率有一定的影响,pH6.0-9.0之间,硫丹降解菌NS降解率较高。当pH<8时,随着pH值的提高,降解率增大;在pH8.0的偏碱性条件下,降解率最高;当pH>8时,随着pH值的升高,降解率降低。综上所述,该菌在偏碱性的条件下降解率达到最大值,说明硫丹降解菌NS降解细菌的最佳pH值为8.0。3)硫丹浓度对降解细菌的生长和降解能力的影响:根据上述2中初始pH值实验的结果,选用最佳pH值8进行实验,控制分离纯化培养基中初始硫丹浓度分别为10、20、50、100、200μg·mL^-1,按3%的接菌量接种硫丹降解菌NS的菌悬液,30°C,160r·min^-1避光振荡培养,5d后取样,测定培养液的OD₆₀₀值,计算降解菌的生长量;重复3次,同时设3个不接菌的对照处理,对培养液中残留硫丹进行提取测定,计算硫丹的降解率。实验结果如图6所示,结果表明:培养液中硫丹的浓度在20μg·mL^-1以下时可以被细菌NS完全降解;硫丹浓度为50-100μg·mL^-1时,两种硫丹异构体能被NS降解掉70-80%;当硫丹浓度增大到200μg·mL^-1时,NS对其的降解率仍能达到60%以上,说明该菌株对高浓度硫丹仍有较高的降解率。4)加菌量对降解细菌的生长和降解能力的影响:根据上述2)、3)、中初始pH值、硫丹浓度的实验结果,选用最佳pH值7和硫丹浓度为100μg·mL^-1进行实验,控制培养液中的加菌量为1%、2%、3%、4%和5%(菌株在分离纯化培养基中的浓度),30°C,160r·min^-1避光振荡培养,5d后取样,测定培养液的OD₆₀₀值,计算降解菌的生长量;重复3次,同时设3个不接菌的对照处理,对培养液中残留硫丹进行提取测定,计算硫丹的降解率。实验结果如图7所示,结果表明:加菌量在2%以下时,细菌的生长量和对硫丹的降解率增长较快;大于2%时细菌的生长量依旧增长,但对硫丹的降解率开始降低;在加菌量为2%时,细菌对硫丹的降解率达到最大。故选定2%为最佳加菌量。5)温度对降解细菌的生长和降解能力的影响:根据上述2)、3)、4)中初始pH值、硫丹浓度及加菌量的实验结果,选用最佳pH值为7、硫丹浓度为100μg·mL^-1、加菌量为3%进行实验。设定振荡培养的温度分别为10、20、30、35、40°C,160r·min^-1避光振荡培养,5d后取样,测定培养液的OD₆₀₀值,计算降解菌的生长量;重复3次,同时设3个不接菌的对照处理,对培养液中残留硫丹进行提取测定,计算硫丹的降解率。实验结果如图8所示,结果表明:培养温度对细菌降解硫丹的影响是随着温度升高降解率先增加后下降的。在30-40°C的温度范围内,NS对硫丹的降解率较高。培养温度低于35°C时,菌株NS对硫丹的降解率持续升高;当培养温度高于35°C时,菌体活性丧失,硫丹的降解率开始下降;35°C时降解率达到最大,在80%左右。说明35°C为硫丹降解菌NS降解细菌的最适宜降解温度。6)最佳条件下菌株NS的生长曲线和硫丹降解曲线:配制硫丹含量为100μg·mL^-1的分离纯化培养基,按2%的接菌量接种硫丹降解菌NS的菌悬液。35°C,160r·min^-1避光振荡培养。重复3次,同时设3个不接菌的对照处理,按照取样时间3d、5d、7d、10d、14d、21d取出试管,测定硫丹的残留浓度,求出降解率。以培养液中硫丹的浓度为纵坐标,取样时间为横坐标,绘制硫丹的降解曲线,即为图9,降解率最高的时间确定为菌株NS降解菌的最佳降解时间。通过以上实验证明:适宜硫丹降解菌NS生长及其对硫丹降解率达到最大时的温度是35°C,pH为8.0,接菌量2%,在最佳温度和pH条件下,硫丹降解菌NS5d内对100μg·mL^-1硫丹的降解率达到80%以上,当硫丹浓度为20μg·mL^-1以下浓度时被NS全部降解,在硫丹浓度为200μg·mL^-1时仍被降解60%以上。实施例4:硫丹降解产物分析代谢产物分析降解液的准备及提取:配制硫丹含量为100μg·mL^-1的分离纯化培养基,40°C,160r·min^-1避光振荡培养5d。取出培养5d后的试管,加入5mL的正己烷,涡旋振荡提取1min,8000rpm/min离心8min;分离收集有机相,上机检测。气-质分析条件:气质联用仪(GC-MS)型号:PExa0Clarus500;PE-5MS毛细管柱。Elite-5MS毛细管气相色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm);载气为氦气,纯度99.999%,流速1.2mL·min^-1;初始柱温为100°C,保持1min,然后以4°C·min^-1升温至240°C,再以10°C/min速率升温到300°C,保持6min,进样器温度290°C。进样方式不分流,进样量1μL。离子源温度200°C,传输线温度250°C,电子倍增器电压500V,质量扫描范围:m/zxa040-500,自动进样。图谱分析方法:质谱分析使用PExa0TurboMass5.1自带数据库分析系统,结合人工物质解析。处理样品的总离子扫描如图10所示,分析图谱可知,硫丹在硫丹降解菌NS作用下降解形成硫丹二醇、硫丹内酯及硫丹醚,并未发现高毒的降解产物硫丹硫酸盐。实施案例5固定化酶的提取制备及应用1.降解菌的培养无菌条件下,将菌株NS接种到含少量碳源培养基上,30°C培养48h。取两接菌环于100mLLB培养基中30°C摇床(转速160rpm)培养24h后,按3%的接菌量(质量比)转接到100mLxa0LB培养基中,在上述条件下培养48h。2.降解酶的提取将培养好的菌株在低温冷冻离心机中,15°C条件下8000rpm离心8min,收集菌体;将菌体用20mL(pH7.0)的0.05mol·L^-1磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)洗涤3次,再以8000rpm离心8min;将菌体1:3(m:v)悬浮于(pH7.0)的0.05mol·L^-1磷酸盐缓冲液中,置于冰水浴中,用超声波细胞粉碎机处理10×1min,功率为280W,破碎5s,间隔5s。破碎之后在4°C,10000rpm离心15min,以除去细胞碎片,得到的上清液即为降解酶粗酶液。3.固定化酶的制备将上述2中的粗酶液与质量分数为3.0%的海藻酸钠溶液按照1:20的体积比混合均匀。再使用注射器将混合液体挤出,使其落入质量分数为4.0%的氯化钙溶液中,形成粒径为1.5-2.0mm的固定化酶。将固定化酶于上述氯化钙溶液中4°C保存4-6h,并储存于4°C备用。4.硫丹降解菌NS降解酶的酶促反应取3mL含100mg·L^-1硫丹的0.05mol·L^-1的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液在35°C水浴中预热10min,然后加入上述提取出的20-30粒固定化酶,反应20min后,用0.2mL1.0mol·L^-1HCl溶液终止酶反应。设3个平行对照,同时设不加固定化酶的处理为对照。按照实施例3中硫丹的提取方法进行提取,用气相色谱测定溶液中硫丹的残留量,并计算其降解率。实验结果表明,硫丹降解菌NS的固定化酶在20min后,对α硫丹、β硫丹的降解率即可分别达到63.5%,64.7%。4.硫丹降解菌NS固定化酶在土壤中的应用按照上述硫丹降解菌NS固定化酶的制备方法,将制备的固定化酶直接投加到硫丹污染土壤中,即可达到快速修复硫丹污染土壤的目的。综上所述,硫丹降解菌NS在偏碱性土壤中对硫丹具有较好的降解作用,其固定化酶可以加快污染土壤中硫丹的降解,并且产物中不产生高毒的降解产物,故而可以降低硫丹对土壤和环境的危害。因此,应用硫丹降解菌NS固定化酶降解偏碱性土壤中的硫丹具有很好的应用前景。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="409"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="652"/>